微生物可行性报告完整版

重组HSV-Ⅱ新型溶瘤病毒疫苗可行性报告 学 院 ： 生物工程学院 专业班级： 生工1501班 学生姓名： 吕永斌 指导教师： 裘娟萍 摘要：经过重组减毒的Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒在体外具有良好的溶瘤效果，经过研究，目前已经能建立以Vero细胞为基质的重组HSV一Ⅱ病毒疫苗反应器微载体无血清悬浮培养生产工艺，最大病毒滴度可达到6.62 lgTCID50／ml以上。为以Vero细胞为基质的无血清病毒疫苗规模化培养提供了一种简便、高效的工艺方法，可计划用于工业化生产。 关键词：重组HSV-Ⅱ；Vero细胞；生物反应器；微载体培养 正文： 1. 产品的意义：目前恶性肿瘤已超过心脑血管类疾病成为首位人类致死性疾病 , 采用Vero细胞培养技术生产的重组溶瘤性Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)具有良好的溶源性、靶向性和安全性 , 具有重要的应用价值。国内人类肿瘤疫苗的有关研究处于刚起步状态，面临多重难题，建立高效的肿瘤疫苗生产工艺具有非常重要的社会和经济价值。经过重组减毒的Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒作为高效新型病毒疫苗有望用于肿瘤的临床研究。 图1.溶瘤病毒的作用机制 2. 生产材料： ① 细胞培养：Vero 细胞 ② 病毒株：重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒HSV—II，中国医学科学院肿瘤研究所提供。 ③ 微载体： Cytodex 1 ④ 生物反应器 图2.产品外观 图3. Cytodex 1微载体 图4.Vero细胞 图5.生物反应器 3. 经济效益： 经查阅ATCC，Vero细胞为免费（不包邮）；病毒株需向中国医学科学院肿瘤研究所申请提供（几乎免费）；微载体Cytodex 1市价为3元/瓶；生物反应器可租借。 成本保守估计（不算设备使用费）：每支成本约为6元，预售价为98元，除去设备费和人工生产费，约可净得利润30RMB/支（1ml）。 4. 生产工艺流程： 图6.生产车间流程图 在反应罐培养间中进行重组HSV—Ⅱ病毒疫苗的微载体悬浮培养，步骤如下： ① Cytodex 1微载体制备：称取一定量Cytodex l置于二甲基二氯硅烷硅化的转瓶／瓶子内，加入PBS(pH 7．2)水化，比例约为80～150 mL／g Cytodex 1，约3h后将PBS倾去，加入新PBS继续水化约3 h(可过夜)，倾去并用新的PBS洗涤一次。高压灭菌121℃ ，30min，冷却后倾去PBS，用培养基洗涤一次后倾去，重新加入新鲜培养基置4℃ 冰箱平衡过夜，待用。PBS继续水化约3 h(可过夜)，倾去并用新的PBS洗涤一次。高压灭菌121℃ ，30 min，冷却后倾去PBS，用培养基洗涤一次后倾去，重新加入新鲜培养基置4~C冰箱平衡过夜，待用。 ② Vero细胞的生物反应器培养：Cytodex 1浓度为3 g／L，接种密度2O～30 cells／MC，转速45 r／min，温度37~C，溶解氧浓度(DO)通过Air，O 和N：的进气比控制在40％空气饱和度，pH通过调节CO 的进气量和7．5％(w／v)NaHCO 控制在7．15～7．2，进行1．5 L／5L反应器培养。 ③ Vero细胞的微载体球转球转移培养：Vero细胞于转瓶／反应器内微载体上培养2～4d，待长成单层时，向培养基中加入一定体积的新微载体，与长满细胞的老微载体按照一定比例混合，进行间歇／连续搅拌培养，待细胞转移贴附成功后，进行常规连续搅拌培养。 ④ Vero细胞的微载体在位消化转移培养：Vero细胞于转瓶／反应器内微载体上培养2～4d，待细胞长成单层，即处于指数生长期时，进行在位消化转移培养。首先停止搅拌，待微载体沉降完全后将培养基排出，用37~C温浴的PBS以约150 ml PBS／g MC的体积洗涤两次。向微载体内加入37~C温浴的胰蛋白酶(含0．02％ (W／V)EDTA 50 ml／g MC)缓慢搅拌约2 min后倾去胰酶液，静止待细胞变圆后，以一定的比例加入含新微载体的培养基，并以一定转速快速搅拌约2 min后，补足培养基并以35～40 r／min的初始搅拌转速连续搅拌培养。约培养12 h待细胞在微载体上完全贴附后，将微载体悬液放大到下一级生物反应器内进行培养。 ⑤ 重组HSV-Ⅱ病毒的反应器培养：Vero细胞于反应器内微载体上培养2～4d，待细胞生长至80％ ～90％ 汇合时，接种病毒。接毒时将反应器内培养基排出并用PBS洗涤2次，加入含BSA的无血清病毒维持液(VD．LSM)，同时将培养温度由37~C降为32％进行病毒培养。待细胞病变至80％ ～90％后，将培养液进行4~C盐裂解，收获病毒。根据计数结果用Reed—Munch公式计算TCID50。 ⑥ 待细胞病变后收获病毒。 5．高效构建技术路线：利用病毒活性增效剂（辅助因子）与重组HSV—Ⅱ病毒疫苗共同左右增强产品效力。具体方案如下：首先选择几种能够增强病毒活性的增效剂M1,M2,M3,M4，设计实验选出能够有效增强该溶瘤病毒的增效剂。设置5个相同的培养基（合适的PH，温度和渗透压）放入等量肿瘤细胞作为唯一营养物质，1-4号分别加入相同剂量的M1,M2,M3,M4增效剂，5号加入等量生理盐水作为对照。放在适宜的环境下培养一定时间后分别对5个培养基中的肿瘤活细胞进行计数，统计并肿瘤活细胞最少的那一组，可以初步得出最佳增效剂。后期反复实验已确定前面结果的正确，最后选出最佳增效剂并适量加入到溶瘤病毒疫苗中，确认其安全性后投入到临床应用。 6．产品的质量标准： 规格：本品为注射剂，1ml/支.每1次人用剂量为1ml，病毒滴度>=6.00 lgTCID50／ml; 重金属：含重金属不得超过百万分之十; 接种部位：手臂三角肌肌肉。 无菌检査：依法检査（通则1101)，应符合规定; 重组病毒疫苗的GMP标准: （i） 在工作场所，保护工人远离生物制剂暴露的风险； （ii） 操作规范，正确谨慎处理转基因释放的（微）生物体或生物体含有重组DNA分子； （iii） 保证人或兽用生物制品和药品的安全性，vero细胞来源的安全性等。 7. 参考文献： [1]Montagnon B，Fanget B，Nicolas A．The large—scale cultivation ofVERO cells in micro-carrier culture for virus vaccine production．Preliminary results for killed poliovirus vaccine．Developments in biologica